dna聚合酶-Nat Commu丨有丝分裂期的特殊DNA合成(MiDAS)需要跨损伤聚合酶Po

生命是从一代向下一代传递的连续性过程，这个过程的最小单位是细胞。人体细胞开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成。在这一过程中，细胞的遗传物质 (DNA) 复制并均等地分配给两个子细胞，这个过程称为细胞周期。按照DNA复制的状况， 细胞周期可以分为4个阶段: G1期（合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期）和M期（细胞分裂期; 含细胞核的有丝分裂期mitosisdna聚合酶，和细胞浆的分裂期cytokinesis）。

在肿瘤细胞的增殖过程中，癌基因的激活会导致DNA复制过程中的压力（replication stress），常表现为复制叉停滞（fork stalling）或瓦解（fork collapse）。在复制压力条件下dna聚合酶，人体细胞基因组中的某些区域不能在DNA合成期（S期）完全复制，形成了未完全复制区域（under-replicated DNA; URD）。2015年，哥本哈根大学Ian D. Hickson 教授课题组、Ying Liu教授课题组、浙江大学沈华浩教授课题组合作研究发现，在复制压力条件下, URD进入有丝分裂期后，可以被一个特殊的有丝分裂期的DNA合成通路（mitotic DNA synthesis; MiDAS）来复制，从而保证了细胞基因组的完整性和细胞的顺利增殖 【1】(图A)。这个发现颠覆了DNA只在S期复制的传统观念,也揭示了MiDAS是缓解DNA复制压力的“最后一道屏障”【1,2】。在大多数的肿瘤细胞中，癌基因的激活会导致DNA复制压力， 它们会依赖MiDAS来维持增殖，因此，抑制MiDAS，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖而不影响正常细胞的生【3-5】。关于MiDAS通路的研究已成为当今肿瘤生物学领域的研究热点。

图A: 有丝分裂期的特殊DNA合成(MiDAS)的代表性荧光成像图。蓝色: 有丝分裂中期的染色体。红色: 用EdU标记的MiDAS。右侧为单个染色体放大示例图。(来自Ying Liu课题组)

MiDAS是一个高度协调，多蛋白参与的DNA损伤修过过程，其具体过程还讫待破晰。至今，根据已报道数据，MiDAS通路大致分为以下四个步骤：a)一旦进入M期，泛素连接酶TRAIP便会降解所有的滞留在复制叉上的复制体（replisome），暴露出复制叉处的DNA【6】；b)暴露的DNA被SLX4内切酶复合体识别并切割，导致复制叉瓦解，形成单端双链断裂 (single-ended double-strand break) 【1,7】；c) RTEL1解旋酶帮助解除特殊的DNA/RNA二级结构【3】；d) RAD52通过单链DNA (ssDNA)进行链交换引发同源重组，最终激活这个依赖于POLD3（DNA聚合酶Polδ的非催化亚基）的DNA合成过程【1,5】。

2023年2月9日，哥本哈根大学Ying Liu(刘英)教授课题组在Nature Communications发表题为Mitotic DNA synthesis in response to replication stress requires the sequential action of DNA polymerases zeta and delta in human cells的研究论文。在这篇文章中，作者着重探讨哪个（或哪些）DNA聚合酶参与了MiDAS的DNA合成过程，以及它（们）是如何被招募到URD区域。

由于POLD3是DNA复制聚合酶Polδ和跨损伤聚合酶Polζ的公共亚基 (图B)，作者大胆设想这两个聚合酶或者其中之一可能参与了MiDAS的合成。首先，作者通过可快速诱导POLD1降解的Auxin-Inducible Degron (AID)系统，发现在有丝分裂期早期（prophase和prometaphase），仅仅30分钟的POLD1降解可以显著抑制MiDAS，说明Polδ在有丝分裂期早期参与了MiDAS的合成。同时，作者惊讶地发现，通过siRNA抑制REV3（Polζ催化亚基）的表达可以同样显著抑制MiDAS的合成，说明Polζ也参与了MiDAS的合成。接下来，作者检测了另外两个跨损伤聚合酶REV1和Polη，发现REV1也参与了MiDAS的合成（备注：REV1在跨损伤DNA合成过程中起着平台支撑作用，通过招募和协调其他跨损伤聚合酶，完成跨损伤DNA合成），但是Polη对MiDAS的合成没有影响。以上结果表明，MiDAS需要至少三种聚合酶协同完成，分别是POLD1（Polδ的催化亚基），REV1，和REV3（Polζ催化亚基）。免疫荧光实验也进一步证实了POLD1和REV1均可被招募到MiDAS的发生位点。

图B: 人体细胞DNA复制聚合酶Polδ和跨损伤聚合酶Polζ的亚基结构示意图。(修改于文献[8])

那么，以上三种聚合酶是如何协同参与MiDAS的合成呢？通过chromatin binding以及巧妙的ultrafine DNA bridge实验，作者确定了REV1/REV3负责MiDAS的起始合成，POLD1负责MiDAS的延伸合成，而POLD3是REV1/REV3与POLD1之间发生相互转换的关键蛋白。有意思的是，作者发现POLD3蛋白的保守RIR区域是POLD3与REV1相互作用的调控关键区，其具体分子机制还有待进一步探索。接下来，作者通过一系列分子细胞生物学实验证明了，复制压力条件下，E3泛素连接酶RAD18（而非CDT2）通过单泛素化PCNA，促进REV1/REV3和POLD1被招募到URD区而发生MiDAS。最后，通过细胞集落形成实验，作者发现抑制REV1的表达可以显著抑制有Cyclin E过表达的癌细胞的增殖，而不影响正常细胞的增殖，说明REV1可能是一个潜在的有效的特异性抗癌靶标。

这项研究揭示MiDAS需要跨损伤聚合酶Polζ和复制聚合酶Polδ依序合作来完成，为以MiDAS为靶点的无副作用的抗癌途径提供了新的前景。丹麦哥本哈根大学Ying Liu(刘英)教授，吴威博士为共同通讯作者，丹麦哥本哈根大学吴威博士，Szymon A. Barwacz博士研究生为共同第一作者。吴威博士现工作于中国浙江大学。

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制版人：十一

参考文献

1 Minocherhomji S, Ying S, Bjerregaard VA, Bursomanno S, Aleliunaite A, Wu Wet al. Replication stress activates DNA repair synthesis in mitosis.Nature2015; 528: 286-290.

2 Zlotorynski E. The cell cycle flavours of repair.Nat Rev Mol Cell Bio2016; 17.

3 Wu W, Bhowmick R, Vogel I, Ozer O, Ghisays F, Thakur RSet al. RTEL1 suppresses G-quadruplex-associated R-loops at difficult-to-replicate loci in the human genome.Nature Structural & Molecular Biology2020; 27: 424-+.

4 Ozer O, Bhowmick R, Liu Y, Hickson ID. Human cancer cells utilize mitotic DNA synthesis to resist replication stress at telomeres regardless of their telomere maintenance mechanism.Oncotarget2018; 9: 15836-15846.

5 Bhowmick R, Minocherhomji S, Hickson ID. RAD52 Facilitates Mitotic DNA Synthesis Following Replication Stress.Molecular Cell2016; 64: 1117-1126.

6 Sonneville R, Bhowmick R, Hoffmann S, Mailand N, Hickson ID, Labib K. TRAIP drives replisome disassembly and mitotic DNA repair synthesis at sites of incomplete DNA replication.eLife2019; 8.

7 Garribba L, Bjerregaard VA, Goncalves Dinis MM, Ozer O, Wu W, Sakellariou Det al. Folate stress induces SLX1- and RAD51-dependent mitotic DNA synthesis at the fragile X locus in human cells.Proc Natl Acad Sci U S A2020; 117: 16527-16536.

8 Johnson RE, Prakash L, Prakash S. Pol31 and Pol32 subunits of yeast DNA polymerase delta are also essential subunits of DNA polymerase zeta.Proc Natl Acad Sci U S A2012; 109: 12455-12460.

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